โคลนหมายถึงขั้นตอนของการแยกลำดับดีเอ็นเอที่กำหนดไว้และได้รับหลายชุดในหลอดทดลอง การโคลนนี้ทำบ่อยครั้งเพื่อขยายชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่มียีน แต่ก็สามารถใช้ในการขยายลำดับดีเอ็นเอดังกล่าวเป็นตัวส่งเสริมที่ไม่เข้ารหัสลำดับที่สังเคราะห์ทางเคมีและการแยกส่วน oligonucleotides สุ่ม DNA ใช้ในการโคลนหลากหลายของการทดลองและการประยุกต์ใช้เทคโนโลยีชีวภาพเช่นการผลิตโปรตีนขนาดใหญ่. [อ้างจำเป็น]
สารบัญ [ซ่อน]
1 ภาพรวม
2 โคลน Recombinase - based
3 ข้อ จำกัด การโคลน ligation /
3.1 การแยกแทรก
3.2 การแปลง
3.3 transfection
3.4 การเลือก
3.5 พันธุวิศวกรรม
3.6 ยีนบำบัด
3.7 เซลล์โคลนและสัตว์
4 อ้างอิง
[แก้ไข] สาระสำคัญ OverviewIn เพื่อที่จะขยายลำดับดีเอ็นเอใด ๆ ในร่างกายและในหลอดทดลอง, ลำดับในคำถามต้องเชื่อมโยงกับองค์ประกอบหลักลำดับความสามารถในการกำกับการจำลองแบบและการขยายพันธุ์ของตัวเองและลำดับการเชื่อมโยงในพื้นที่เป้าหมายที่ต้องการ องค์ประกอบที่แตกต่างกันตามลำดับที่ต้องการเป็นเจ้าภาพ แต่อย่างสม่ำเสมอรวมถึงจุดเริ่มต้นของการจำลองแบบและยีนเครื่องหมาย อย่างไรก็ตามในทางปฏิบัติจํานวนคุณสมบัติอื่น ๆ ที่เป็นที่ต้องการและความหลากหลายของการโคลนเฉพาะเวกเตอร์อยู่ที่ช่วยให้การแสดงออกของโปรตีน, แท็ก, เดี่ยวตีเกลียวการผลิตอาร์เอ็นเอและดีเอ็นเอและโฮสต์ของ manipulations อื่น ๆ ที่เป็นประโยชน์ในการใช้งานต่อเนื่อง. [อ้างจำเป็น]
[แก้ไข] ขั้นตอนนวนิยาย Recombinase - based cloningA ของการโคลนหรือ subcloning ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอใด ๆ โดยการใส่ชิ้นส่วนดีเอ็นเอพิเศษที่น่าสนใจลงไปในพื้นที่พิเศษของ DNA เป้าหมายผ่านการแลกเปลี่ยนของชิ้น DNA ที่เกี่ยวข้อง. [1]
นี่คือปฏิกิริยาขั้นตอนเดียว : subcloning ง่ายมีประสิทธิภาพสูงผ่านการอำนวยความสะดวกหรือการโคลนอัตโนมัติและ / หรือ [2].
[แก้ไข] ข้อ จำกัด cloningIn ligation / ข้อ จำกัด คลาสสิกและโปรโตคอลการโคลน ligation, การโคลนชิ้นส่วนดีเอ็นเอใด ๆ เป็นหลักเกี่ยวข้องกับการสี่ขั้นตอนคือ DNA fragmentation กับ endonucleases ข้อ จำกัด ของชิ้น DNA ligation เพื่อเวกเตอร์, transfection, การคัดกรองและการเลือก ถึงแม้ว่าขั้นตอนเหล่านี้จะคงที่ในขั้นตอนการโคลนจำนวนเส้นทางของทางเลือกที่สามารถเลือกได้หลายจุดขึ้นอยู่กับโปรแกรมเฉพาะ. เหล่านี้สามารถสรุปได้'กลยุทธ์การโคลน'[อ้างจำเป็น]
[แก้ไข] การแยก insertInitially, ชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่จะโคลนจะต้องมีการแยก การเตรียมชิ้น DNA สำหรับการโคลนสามารถทำได้ในหลายทางเลือก การเตรียมการแทรกคือความบ่อยโดยปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอ แต่มันอาจจะสำเร็จได้โดยการย่อยอาหารเอนไซม์ จำกัด , sonication DNA และการแยกโดยอะกาโรสเจลอิเลค สารเคมีสังเคราะห์ oligonucleotides ยังสามารถใช้ในกรณีที่เป้าหมายลำดับขนาดไม่เกินขอบเขตของการสังเคราะห์สารเคมี การแยกแทรกสามารถทำได้โดยใช้ปืนลูกซองโคลน, โคลน DNA - C, เครื่องยีน (การสังเคราะห์สารเคมีสังเคราะห์). [อ้างจำเป็น]
[แก้ไข] TransformationFollowing ligation, ผลิตภัณฑ์ ligation (พลาสมิด) จะถูกเปลี่ยนเป็นแบคทีเรียสำหรับการขยายพันธุ์ แบคทีเรียสามารถชุบจากนั้นบนอาหารเลี้ยงเชื้อที่เลือกเพื่อเลือกสำหรับแบคทีเรียที่มีพลาสมิดที่น่าสนใจ โคโลนีส่วนบุคคลจะเลือกและทดสอบการแทรกต้องการ Maxiprep สามารถทำได้เพื่อให้ได้ปริมาณมากพลาสมิดที่มียีนที่แทรก. [อ้างจำเป็น]
[แก้ไข] ligation TransfectionFollowing, ส่วนของการเกิดปฏิกิริยา ligation รวมถึงเวกเตอร์ที่มีแทรกในทิศทางที่ต้องการเป็น transfected เข้าสู่เซลล์ จำนวนเทคนิคทางเลือกที่สามารถใช้ได้เช่นแพ้สารเคมีของเซลล์ electroporation และ biolistics ทำให้มีความรู้สึกทางเคมีของเซลล์ที่เป็นลูกจ้างประจำตั้งแต่นี้ไม่ต้องใช้อุปกรณ์พิเศษและให้ประสิทธิภาพในการเปลี่ยนแปลงค่อนข้างสูง Electroporation จะใช้เมื่อมีประสิทธิภาพสูงมากการเปลี่ยนแปลงจะต้องเป็นในกลยุทธ์การโคลนไม่มีประสิทธิภาพมาก Biolistics ถูกนำมาใช้เป็นหลักในการแปลงเซลล์พืชที่ผนังเซลล์เป็นอุปสรรคสำคัญในการนำดีเอ็นเอจากเซลล์ สังเกตการเปลี่ยนแปลงของแบคทีเรียโดยทั่วไปโดยการคัดกรองสีขาวสีฟ้า. [อ้างจำเป็น]
[แก้ไข] SelectionFinally, มีการเพาะเลี้ยงเซลล์ transfected เป็นขั้นตอนดังกล่าวจะมีประสิทธิภาพต่ำโดยเฉพาะอย่างยิ่งมีความจำเป็นต้องระบุเซลล์ที่มีแทรกที่ต้องการที่วางที่เหมาะสมและแยกเหล่านี้จากผู้ที่ไม่ได้เปลี่ยนเรียบร้อยแล้ว โมเดิร์นพาหะโคลนรวมถึงเครื่องหมายที่เลือก (ส่วนใหญ่ทนต่อยาปฏิชีวนะบ่อยเครื่องหมาย) ที่อนุญาตให้เฉพาะเซลล์ที่เวกเตอร์, แต่ไม่จำเป็นต้องใส่ได้รับการ transfected ที่จะเติบโต นอกจากนี้เป็นพาหะการโคลนอาจมีเครื่องหมายของการเลือกสีที่ให้สีฟ้า / คัดกรองสีขาว (ผ่าน complementation α - factor) ในสื่อ X - สาว อย่างไรก็ตามขั้นตอนการเลือกเหล่านี้ไม่ได้อย่างแน่นอนรับประกันได้ว่าแทรก DNA อยู่ในเซลล์ ตรวจสอบต่อไปของโคโลนีที่เกิดจะต้องยืนยันการโคลนนิ่งที่ประสบความสำเร็จ นี้อาจจะสำเร็จได้โดยวิธีการ PCR การวิเคราะห์ชิ้นส่วนข้อ จำกัด และ / หรือการหาลำดับดีเอ็นเอ. [อ้างจำเป็น]
[แก้ไข] พันธุวิศวกรรม (สำหรับหน้าเต็มเห็นพันธุวิศวกรรม)
พันธุวิศวกรรมเป็นวิธีการของการเปลี่ยนแปลงลักษณะทางพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตในทางที่กำหนดไว้ล่วงหน้าโดยการเปลี่ยนสารพันธุกรรมของ นี้มักจะทำเพื่อให้จุลินทรีย์เช่นแบคทีเรียหรือไวรัส, การสังเคราะห์ผลผลิตเพิ่มขึ้นของสารเพื่อฟอร์มทั้งหมดสารใหม่หรือปรับให้เข้ากับสภาพแวดล้อมที่แตกต่างกัน อื่น ๆ ของการใช้เทคโนโลยีนี้ซึ่งจะเรียกว่าเทคโนโลยีดีเอ็นเอสายผสม, รวมถึงการรักษาด้วยยีนซึ่งเป็นแหล่งของยีนที่ทำหน้าที่ให้กับบุคคลที่มีความผิดปกติทางพันธุกรรมหรือโรคอื่น ๆ เช่นโรคภูมิคุ้มกันบกพร่องที่ได้มา (AIDS) หรือโรคมะเร็งและ โคลนของสิ่งมีชีวิตทั้งหมด. [อ้างจำเป็น]
พันธุวิศวกรรมเกี่ยวข้องกับการจัดการของดีเอ็นเอหรือดีเอ็นเอ เครื่องมือที่สำคัญในกระบวนการนี้มีข้อ จำกัด endonucleases (เอนไซม์ที่เรียกว่าข้อ จำกัด ) ที่มีการผลิตโดยแบคทีเรียสายพันธุ์ต่างๆ เอนไซม์ Restriction สามารถจดจำลำดับโดยเฉพาะอย่างยิ่งของห่วงโซ่ของหน่วยเคมีที่เรียกว่าฐานเบสที่ช่วยให้การขึ้นโมเลกุลดีเอ็นเอและการตัด DNA ที่ตำแหน่งนั้น ชิ้นส่วนของดีเอ็นเอที่สร้างขึ้นในลักษณะนี้สามารถเข้าร่วมโดยใช้เอนไซม์อื่น ๆ เรียกว่า ligases ข้อ จำกัด และ ligases เอนไซม์จึงอนุญาตให้เฉพาะการตัดและ reassembling ของบางส่วนของดีเอ็นเอ ยังมีความสำคัญในการจัดการของดีเอ็นเอเป็นพาหะที่เรียกว่าซึ่งเป็นชิ้นส่วนของดีเอ็นเอที่สามารถทำซ้ำตัวเอง (ผลิตสำเนาของตัวเอง) อิสระของดีเอ็นเอในเซลล์เจ้าบ้านในการที่พวกเขาจะเติบโตขึ้น ตัวอย่างของพลาสมิดพาหะรวมถึงไวรัสและโครโมโซมเทียม อนุญาตให้มีการสร้างเวกเตอร์หลายแห่งโดยเฉพาะชิ้นส่วนของดีเอ็นเอ, การทำวิธีนี้มีประโยชน์สำหรับการสร้างปริมาณที่เพียงพอของวัสดุที่มีที่ทำงาน กระบวนการทางวิศวกรรมชิ้นส่วนดีเอ็นเอเป็นเส้นเรียกว่า"โคลน"เพราะหลาย ๆ ชุดของโมเลกุลที่เหมือนกันของดีเอ็นเอมีการผลิต วิธีการผลิตที่เหมือนกันหลายชุดโดยเฉพาะอีกประการหนึ่ง (มักจะสั้นเช่น 100-3,000 คู่เบส) ชิ้นส่วนดีเอ็นเอเป็นปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอ วิธีนี้เป็นวิธีที่รวดเร็วและหลีกเลี่ยงความจำเป็นในการโคลนดีเอ็นเอเป็นเวกเตอร์. [อ้างจำเป็น]
[แก้ไข] การรักษาด้วยยีนที่เกี่ยวข้องกับการจัดหา therapyGene ยีนทำงานไปยังเซลล์ขาดฟังก์ชั่นที่มีจุดมุ่งหมายของการแก้ไขความผิดปกติทางพันธุกรรมหรือโรคที่ได้มา ยีนบำบัดสามารถแบ่งได้อย่างกว้าง ๆ ออกเป็นสองประเภท วิธีแรกคือการเปลี่ยนแปลงของเซลล์สืบพันธุ์ซึ่งก็คือตัวอสุจิหรือไข่ที่มีผลในการเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรมถาวรสำหรับสิ่งมีชีวิตทั้งหมดและรุ่นที่ตามมา นี้"สายเชื้อยีนบำบัด"คือการพิจารณาโดยมากจะขาดจริยธรรมในมนุษย์ ประเภทที่สองของการรักษาด้วยยีน"ยีนบำบัดเซลล์โซมาติก"จะคล้ายกับการปลูกถ่ายอวัยวะ ในกรณีนี้อย่างน้อยหนึ่งเนื้อเยื่อมีการกำหนดเป้าหมายโดยเฉพาะการรักษาโดยตรงหรือโดยการกำจัดของเนื้อเยื่อการเติมยีนหรือยีนบำบัดรักษาในห้องปฏิบัติการและผลตอบแทนของเซลล์ที่รับการรักษากับผู้ป่วย การทดลองทางคลินิกของยีนบำบัดเซลล์ร่างกายเริ่มในปลายปี 1990 ส่วนใหญ่ในการรักษาโรคมะเร็งและเลือด, ตับ, ปอดและความผิดปกติ. [อ้างจำเป็น]
ประวัติของการรักษาด้วยยีนของมนุษย์เป็น แต่ไม่ได้โดยเฉพาะอย่างยิ่งมีความสุขหนึ่ง ผลของการนำยีนเข้าสู่เซลล์ไม่ค่อยส่งเสริมมากกว่าการบรรเทาชั่วคราวขนาดเล็กจากอาการของโรคที่กำลังรับการรักษา เลวยังคงมีรายได้รับการเผยแพร่อย่างมากที่ทดลองยีนบำบัดผู้ป่วยได้รับความเดือดร้อนเป็นผลของการรักษาตัวเอง ตัวอย่างเช่นในปี 1999 ยีนบำบัด 18 ปีอาสาสมัครทดลองใช้จาก Philadelphia เสียชีวิตดังต่อไปนี้การทดลองยีนบำบัด นอกจากนี้หนึ่งในไม่กี่เรื่องราวความสำเร็จของยีนบำบัดรักษามนุษย์ที่ภูมิคุ้มกันบกพร่องรุนแรงรวม, X - SCID - ได้เปิดออกมามีผลกระทบอย่างคาดไม่ถึง กระดูกเซลล์ไขกระดูกได้หายไปจากผู้ป่วยทุกข์ทรมานจากโรคนี้และรับการรักษาด้วยเชื้อไวรัสที่จะแนะนำคัดลอกการทำงานของยีนที่บกพร่อง เมื่อแก้ไขเซลล์กระดูกไขกระดูกที่ได้รับกลับไปยังผู้ป่วยระบบภูมิคุ้มกันของพวกเขาทำงานอีกครั้งหนึ่ง อย่างไรก็ตามผู้ป่วยบางรายรับการรักษาด้วยวิธีนี้พัฒนาต่อมามะเร็งเม็ดเลือดขาวซึ่งส่วนใหญ่เกิดขึ้นเป็นผลมาจากการสุ่มแทรกของส่วนของดีเอ็นเอในจีโนมมนุษย์กับการหยุดชะงักเกิดขึ้นเนื่องจากการทำงานของยีนในบริเวณใกล้เคียง. [อ้างจำเป็น]
[แก้ไข] เซลล์การโคลนและพันธุวิศวกรรม animalsIn,"โคลนนิ่ง"ระยะเวลาขณะนี้นำมาใช้มากกว่าปกติเพื่อโคลน organismal การผลิตของสัตว์ที่เหมือนกันมากกว่าการโคลนระดับโมเลกุลของชิ้นส่วนดีเอ็นเอ เซลล์ทั้งหมดหรือโคลนสัตว์เกิดขึ้นโดยโอนผ่านของนิวเคลียสของเซลล์ผู้ใหญ่เป็นไข่ enucleated ซึ่งจะส่งผลใน reprogramming ของดีเอ็นเอเซลล์ผู้ใหญ่ในการผลิตสัตว์โคลน ในปี 1997 แกะชื่อดอลลี่เกิดที่ Roslin สถาบันในเอดินเบอระ เธอถูกสร้างขึ้นมาจากนิวเคลียสของเซลล์เพาะเลี้ยงจากต่อมน้ำนมแกะ Finn Dorset ที่ได้รับการผสมกับเซลล์ไข่จากแกะสกอต Blackface ที่ได้มีนิวเคลียสของตัวเองออก เซลล์ถูกฝังลงในผสมที่แตกต่างกันแกะสกอต Blackface และต่อไปนี้การตั้งครรภ์ปกติ, ดอลลี่, แกะ Finn Dorset, เกิด นิวเคลียร์ได้รับการโอนต่อมานำมาใช้ในการผลิตช่วงของสัตว์โคลนรวมทั้งวัว, แพะ, แมวหมูหนูและ
